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一.(1)CTAB缓冲液方法 

 

这是最广泛地用来分离植物DNA的方法,对大多数植物种都适用,特别是当样本数量很小时。

此法运用阳离子去污剂CTAB溶解植物细胞膜并与DNA形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织,而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织。另外,此法对样品数量的要求也不高,从小到毫克数量的标本(木乃伊、化石)许多克的新鲜材料均可使用。

步骤 :

1、加热分离缓冲液、研钵、研杵到60℃。 

2、在热研钵中放人0.5-1.5g新鲜或冰冻的叶子,用7.5ml2倍CTAB分离缓冲液研磨(可加些石英砂帮助研磨).对冻干的组织用1倍CTAB缓冲液研磨。把研碎的组织倒入50ml管中,再用0.5ml 2倍CTAB缓冲液冲洗研钵将冲洗液加到管中。 

3、将试管在60℃下放置30-60分钟,然后轻轻振荡,使之充分混合后降至室温。 

4、在试管中加入10ml氯仿-异戊醇24:1萃取液(如颜色深可再进行一次)轻轻摇晃使其混合在室温下1500r/min离心5分钟,使其分相。 

5、将上层的水相倒入,15ml管中 加2/3体积的冷异丙醇,轻轻混合以沉淀核酸。(如果看不到核酸沉淀可在20℃下放置20分钟或更长时间) 

6、室温下 800r/min离心 3-5分钟,如果看不到小团或沉淀,可在-20℃下放置 20分钟再离心。 

7、小心地倒掉上清液,不要倒掉核酸,这时的核酸一般松散地贴在管的底部加 15ml清洗缓冲液轻轻地旋转清洗沉淀物15-20分钟后核酸将变得更白。 

8、室温下800r/min离心5分钟。如不充分,则加大离心速度或延长离心时间。倒掉清洗缓冲液,将管倒扣在纸巾上,让沉淀物干燥,小心不要让DNA滑掉。 

9、按沉淀物的大小用少量悬浮缓冲液(10-100 µl)悬浮DNA。 

10、用100µg/ml RNAase在 37℃下温育 30-60分钟。 

11、如果组织包含单宁或其他次级产物,可以对  DNA作进一步纯化。可用氯仿、苯酚纯化。一些材料可能需要用氯铯 CsCl梯度纯化。上述方法也可以进行改进,像巯基乙醇的浓度可以提高至 25mmol/dm也 可加入 l%的抗坏血酸、DTT等。CTAB也可用 SDS取代也可用 TE(10mmol/dm3Tris-HCIpH值 8.0lmmol/dm3EDTA)作悬浮缓冲液。

 

 (2)CTAB沉淀法 

 

  步骤 :

1、与上方法中中前4个步骤同。 

2、吸取上层水相,将其例入一个15ml管中。 

3、加 3倍体积的沉淀缓冲液,使NaCI的浓度减少到 0.35mol/dm3  室温下放置 30分钟。 

4、室温下 2 000r/min离心 5分钟,以沉淀 DNA。 

5、根据沉淀物的大小,用少量的悬浮缓冲液(10-100µl)悬浮DNA。 

6、虽然氯仿或苯酚提取DNA是有效的,但是对那些包含单宁或其他次级产物的组织,可以在氯化铯梯度上进一步纯化。 

 

二.蛋白质沉淀方法 

 

 这个方法可以产生高质量的DNA但产量也是最低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸钾沉淀蛋白质和多糖此方法不需要有机提取而且快速所以对大量样品比较合适。 

 

步骤 :

1、用液氮在研钵中研磨1.0g新鲜叶子.可以加一些石英砂帮助研磨。将研磨完毕的粉末贮存在-80℃冰箱中,在加提取液之前,不要让植物材料融化。 

2、在冰冻的组织中加 6ml提取缓冲液,转到一个15ml的离心管中,充分振荡大约 30秒钟,使之混合均匀,然后在65℃下放置20分钟。 

3、往管中加入2ml 5mol/dm3乙酸钾,(pH值6.5)充分摇匀,在冰水中放置5分钟。随着不溶的十二烷基硫酸钾的沉淀,大部分蛋白质和多糖作为复合物被除去了。 

4、在 4℃下 2 000r/min离心 20分钟。 

5、吸出上清液,将其倒入一个干净的 15ml的离心管中,不要带入颗粒物质,然后加 4ml异丙醇轻轻混合,在-20℃下放置。 

6、在4℃下 2 000r/min离心 15秒钟,DNA沉淀后轻轻地倒掉上清液,在纸巾上倒扣10分钟或更长时间,以干燥沉淀物。 

7、将沉淀物放在 100TE中溶解,然后将溶液倒入一个1、sml离心管中,离心 5分钟,移去不溶的沉淀。 

8、将管中上清液倒入另一个 1.5ml离心管中,加 75µl 3mol/dm3NaAcpH值 7.6和500µl冷异丙醇,充分混合,在—20℃下放置1-2小时,拿出后再在室温下放10秒钟,使管中DNA沉淀。 

9、用 500µl 80乙醇洗沉淀物 10分钟,离心 1分钟干燥沉淀物 10分钟。 

10、根据DNA沉淀物的大小用少量的 TE(10-100µl)溶解DNA。 

 

三、氯化铯方法 

 

 这个方法的原理是根据在氯化铯(CsCl)中的不同密度梯度来分离细胞成分。此方法

可以产生大量高纯度的DNA,但费时,而且需昂贵的仪器设备,对需要复杂的有机提取或

沉淀的材料比较适合在一些情况下。它可能是在含大量次级产物的植物中提取高质量DNA的唯一方法。DNA可以在一个平衡的CsCl梯度中通过与以下几个染料中的一个结合而被纯化这几个染料为溴化乙锭、碘化丙锭它们不同的浮力密度对分离不同的染色体组特别有用。 

 

四.PCR小量制备法 

 

此方法的优点是一次可以提纯很多样品,比较快速,而且小于10mg(50mm)的新鲜叶子材料就可以产生足够的DNA,产生的DNA对杂交实验是可用的。这个方法存在的问题是DNA沉淀物可能不够紧密,或不一定能形成一紧密的DNA沉淀。 

步骤 

1、用1.5ml离心管研磨小的组织样品。可取管口大小的新鲜叶子(10mg)冻在液氮中的叶子也可用。 

2、在研碎的样品中加 400µl的分离缓冲液用适合的速度涡旋 10秒钟以分散开样品。 

3、在室温下将1.5ml离心管中样品离心 12-15分钟沉淀细胞内物质。 

4、收集300µl的上清液弃去沉淀。 

5、在上清液中加300µl预冷异丙醇倒转样品1-3次使之充分混合在室温下至少放置5分钟。 

6、将微离心管中的样品在室温下离心20分钟以收集沉淀的DNA。 

7、弃去上清液用300µl 80%的乙醇室温下沉淀 10分钟。 

8、室温下离心样品12分钟弃去上清液。 

9、用300µl 80%的乙醇再洗后室温下离心 5分钟弃去上清液。 

10、室温下干燥样品1小时或将样品放过夜。 

11、用 100µl TE悬浮样品。