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一.蛋白酶K硝化法

1取动物组织100mg左右于样品管中用干净的剪刀将组织块剪碎/组织匀浆机

2在样品管中加入如下试剂 

500µl STE溶液   25 µl蛋白酶 K(Proteinase K10 mg/ml)  75µl 10% SDS 

3混匀后置56℃下消化2小时以上隔一定时间混匀一次。 

4加人等体积的饱和酚溶液轻轻颠倒混合5分钟以上用于rDNA和RAPD分析的样品需抽提24小时。 

57 000rmin离心5分钟。 

6小心将上层清液移至另一干净的离心管中加入等体积的苯酚及氯仿并重复步骤4和5的抽提过程。 

7以等体积的氯仿内含1/25体积的异戊醇重复步骤4和5的抽提过程。 

8在上清液中加入 1/10体积的 3mol/dm3NaAc或 5mol/dm3NHAc、2倍体积的冷无水乙醇或1倍体积的异丙醇以沉淀DNA。 

9置—70℃下沉淀2小时或置—20℃下沉淀过夜。 

107 000r/min离心10分钟再以 70%冷乙醇洗涤DNA沉淀一次。将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥。 

11以适量的TE溶液(200~500µl)溶解DNA样品。 

12以分光光度计测定DNA的浓度260nm260/280nm的光密度比值应在 1.8以上否则提示可能有蛋白质或苯酚的污染。 

13以TE溶液将DNA样品稀释成所需的工作液的浓度。 

14取2µl 左右的样品进行电泳检测以判断 DNA是否有降解以及是否需要消除RNA。 

微量动物组织样品的总DNA提取方法 

 此方法的基本原理是采用一种螯合剂提取DNA。此方法简便、快速提取后的DNA样品可以直接作为PCR的模板。具体的操作步骤如下 

1取一小块冰冻的组织少于1mg可用经消毒的枪头钻取或1-3根带有毛根的毛发(需先经 90%、70%的乙醇和灭菌水依次清洗)并剪去毛干部分,或 1-5µl血液加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入 500µl 5%的Chelex溶液。 

2将样品管在56℃下放置1小时或更长时间直至组织样品成粉末状不同组织所需时间各不相同。 

3在振荡器上振荡10-15秒钟。 

4在 95-100℃下煮 15-40分钟。 

5在振荡器上振荡10-15秒钟。 

6将样品管在4℃下保存进行PCR反应之前再次离心使Chelex颗粒沉淀。取上清液1-10µl作为DNA模板。